H. wurde 1801 nach Berlin als Leibarzt für Friedrich Wilhelm III. und dessen Familie berufen. Damit verbunden war die Übernahme der Leitung der militär- und wundärztlichen Ausbildungsstätten sowie die Stellung des Ersten Arztes der Charité. Daneben machte sich H. um das Armenwesen verdient und förderte die Einführung der Pockenschutzimpfung. Zu diesem Zweck initiierte er 1802 die Einrichtung einer Impfanstalt. 1810 Mitglied der Akademie der Wissenschaften geworden, zählte er zu den Gründern der Berliner Universität ( Humboldt-Universität), an der er der erste Dekan der Medizinischen Fakultät und Inhaber des Lehrstuhls für spezielle Pathologie und Therapie wurde. Im selben Jahr eröffnete er eine Poliklinik für unbemittelte Kranke, die er für die praktische Ausbildung der Studenten nutzte. Er begründete die Medicinisch-Chirurgische Gesellschaft, ab 1833 Hufelandsche Gesellschaft zur Fortbildung der Ärzte und initiierte 1830 die Hufelandsche Stiftung für notleidende Ärzte. H. wohnte ab 1801 in der Charlottenstraße, dann in der Villa Friedensthal im Tiergarten und ab 1804 in der heutigen Dorotheenstraße (früher Letzte Straße) 3. Sein Ehrengrab befindet sich auf dem Friedhof der Dorotheenstädtischen und Friedrichswerderschen Gemeinden. Das Christoph-Wilhelm-Hufeland-Krankenhaus (Pankow) sowie die Hufelandstraße (Prenzlauer Berg) tragen seinen Namen. Eine Gedenktafel am Haus Dorotheenstraße 16 und ein Denkmal in Pankow erinnern an den Mediziner.