W. wurde 1888 promoviert und ging zwei Jahre später als Asssistent an das von Robert Koch in Berlin geleitete Institut für Infektionskrankheiten. Zehn Jahre später wurde er Titularprofessor und Oberarzt an der Charité, habilitierte sich 1901 und erhielt 1902 eine außerordentliche Professur. Ab 1906 leitete W. die Abteilung für experimentelle Therapie und Biochemie des Kochschen Instituts. 1911 zum ordentlichen Professor ernannt, übernahm er 1913 die Leitung des neugegründeten Instituts für experimentelle Therapie der Kaiser-Wilhelm-Gesellschaft in Dahlem. W. arbeitete erfolgreich auf den Gebieten der Immunologie, der Bakteriologie und Serologie, der Tuberkulose- und der Krebsforschung. Durch die erstmals 1906 veröffentlichte und nach ihm benannte Blutreaktion bei Syphilis (Wassermannsche Reaktion) wurde er weltbekannt. Der 1907 zum Geheimen Medizinalrat ernannte W. wohnte 1898 Kronprinzenufer 15, bis 1911 in der Rauchstraße 7, 1913 bis 1924 in der Rauchstraße 26. Sein Ehrengrab befindet sich auf dem Urnenfriedhof Gerichtstraße. Die Wassermannstraße in Treptow wurde nach ihm benannt.